熒光定量PCR(qPCR)儀是分子生物學研究、臨床診斷(如新冠病毒檢測)等領域的核心設備，其準確性直接影響實驗結果的可靠性。校正(校準)是確保qPCR儀性能穩(wěn)定的關鍵步驟，需定期對溫控系統(tǒng)(溫度控制精度)和光學系統(tǒng)(熒光信號檢測)進行系統(tǒng)性驗證與調整。
一、校正的核心目標
qPCR儀的校正旨在確保以下關鍵性能指標符合要求：
溫控系統(tǒng)：溫度示值誤差(設定溫度與實際溫度的偏差)、溫度均勻度(反應孔間溫差)、溫度波動度(溫度隨時間的變化)、溫度最大過沖量(升溫/降溫過程中超出設定值的幅度)、平均升降溫速率(升溫/降溫的速度)。
光學系統(tǒng)：熒光強度精密度(同一孔熒光信號的一致性)、閾值循環(huán)數(Ct值)精密度(不同孔Ct值的一致性)、熔解溫度(Tm值)漂移(熒光強度下降一半時的溫度偏差)、熒光線性相關系數(熒光強度與核酸濃度的線性關系)。
二、校正前的準備工作
1. 環(huán)境條件
溫度：15–30℃(避免溫度波動影響校準結果)；
相對濕度：20–85%RH(防止儀器受潮)；
電源：穩(wěn)定電壓(建議使用UPS)，避免斷電影響校準進程。
2. 設備與材料
標準物質：需使用有證標準物質(如質粒DNA、核糖核酸標準物質)，其特性量值(拷貝數≥10? copies/μL)及相對擴展不確定度(≤5%)需符合JJF(津)04-2020要求；
校準設備：光學模擬器(集成溫度傳感器與發(fā)射光發(fā)生器，溫度測量范圍0–120℃，最大允許誤差±0.1℃；發(fā)射光波長360–780nm，相對光輻射強度可調)、多通道溫度校驗儀(如JDPC-96，用于測量反應孔間溫差)；
耗材：專用校準板(如AB7500 ROI校準板、背景校準板)、移液器(2μL、10μL等，需計量檢定合格)、無粉手套(防止污染校準板)。
三、校正的主要流程
qPCR儀的校正流程需嚴格遵循JJF(津)04-2020《實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范》，主要包括溫度系統(tǒng)校準與光學系統(tǒng)校準兩部分，以下以AB7500系列儀器為例說明具體步驟：
（一）溫度系統(tǒng)校準
溫度是qPCR反應的核心參數，直接影響DNA擴增效率。溫度系統(tǒng)校準需使用光學模擬器(替代反應管)，模擬實際反應中的溫度變化，驗證儀器的溫度控制性能。
1. 校準前準備
將光學模擬器與qPCR儀連接，確保下方溫度傳感器與上方熒光發(fā)射光源與儀器均熱塊接觸良好；
在光學模擬器下涂抹導熱油，增強熱傳導；
打開儀器軟件，選擇“校準”模塊，進入“溫度校準”程序。
2. 校準程序
預熱：設定儀器溫度為23℃，運行預熱程序(約10分鐘)，使儀器達到穩(wěn)定狀態(tài)；
溫度點設置：選擇9個溫度點(30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等)，每個溫度點持續(xù)2分鐘(用于測量溫度示值誤差、均勻度、波動度)；
升溫/降溫過程：從50℃升溫至90℃(測量平均升溫速率)，再從90℃降溫至50℃(測量平均降溫速率)；
數據采集：儀器自動記錄每個溫度點的設定溫度(Ts)、實際溫度平均值(T?)、溫度波動值(T_v)、最大過沖值(T_os)。
3. 結果計算
溫度示值誤差：△T = Ts - T?(要求≤±0.5℃)；
溫度均勻度：△Tu = T_umax - T_umin(T_umax為所有孔溫度最大值，T_umin為最小值，要求≤1.0℃)；
溫度波動度：△T_v = ±(T_max - T_min)/2(T_max為單個孔溫度最大值，T_min為最小值，要求≤0.2℃)；
溫度最大過沖量：△T_os = Tosmax - Ts(Tosmax為所有孔過沖值最大值，要求≤3.0℃)；
平均升溫速率：v_up = (TB - TA)/tut(TB為90℃溫度點平均值，TA為50℃溫度點平均值，tut為升溫時間，要求≥4℃/秒)；
平均降溫速率：v_down = (TB - TA)/tdo(tdo為降溫時間，要求≥3℃/秒)。
（二）光學系統(tǒng)校準
光學系統(tǒng)負責檢測熒光信號，其準確性直接影響Ct值與核酸濃度的定量結果。光學系統(tǒng)校準需使用專用校準板(如AB7500 ROI校準板)，調整熒光檢測器的靈敏度與信號一致性。
1. 背景校準
目的：消除儀器本底熒光(如電子信號、塑料耗材污染)的干擾；
步驟：
(1)取出背景校準板(需室溫放置5分鐘，避免冷凝水)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“背景校準”程序(約30分鐘)；
(3)軟件自動記錄背景熒光信號，生成背景校正文件(后續(xù)實驗中自動扣除)。
2. ROI（感興趣區(qū)域）校準
目的：將反應板上的孔位映射到儀器檢測器，確保每個孔的熒光信號準確采集；
步驟：
(1)取出ROI校準板(標準板或快速板，需渦旋5秒并離心2分鐘)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“ROI校準”程序；
(3)軟件自動拍攝每個濾光片的圖像，生成ROI掩碼(每個孔周圍顯示綠色圓圈，表明校準成功)；
(4)若圖像過飽和(孔內熒光過強)，需調整曝光時間(如從2048減少至1024)，重新采集圖像。
3. 光學校準
目的：補償光學系統(tǒng)的物理效應(如濾光片的光譜響應)，確保熒光信號的準確性；
步驟：
(1)選擇“光學校準”程序，加載ROI校準文件；
(2)運行程序(約10分鐘)，軟件自動分析熒光信號的光譜特征，生成光學校正文件。
4. 染料校準
目的：驗證不同染料(如FAM、VIC、ROX)的熒光信號準確性，確保多染料實驗的可靠性；
步驟：
(1)取出染料校準板(包含多種熒光染料，如CY3、CY5、FAM等)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“染料校準”程序；
(3)軟件自動采集每個染料的熒光光譜，生成染料校正文件(后續(xù)實驗中自動識別染料信號)。
（三）結果記錄與證書
校準完成后，需出具CNAS認證的校準證書，包含以下內容：
(1)儀器基本信息(型號、序列號、生產廠家)；
(2)校準環(huán)境條件(溫度、濕度、時間)；
(3)校準結果(溫度示值誤差、均勻度、光學系統(tǒng)精密度等)；
(4)校準人員與審核人員簽名；
(5)校準機構資質(CNAS認可編號)。
四、校正的注意事項
1. 校準周期
建議每12個月進行一次全面校準(符合JJF(津)04-2020要求)；
高使用頻率(如每天運行10次以上)或關鍵應用(如臨床診斷)下，可縮短至6個月一次；
儀器搬遷、維修或更換關鍵部件(如加熱塊、檢測器)后，需重新校準。
2. 專業(yè)支持
校準需由廠家工程師或具備資質的第三方機構(如天津市計量監(jiān)督檢測科學研究院)執(zhí)行，確保符合SOP(標準操作程序)；
禁止非專業(yè)人員自行調整儀器參數(如溫度設置、光學濾光片)，以免影響校準結果。
3. 校準后的驗證
校準完成后，需運行標準物質驗證實驗(如質粒DNA標準物質)，檢測Ct值的重復性(變異系數≤3%)與線性相關系數(R²≥0.99)，確保校準效果；
若驗證結果不符合要求，需重新校準或聯(lián)系廠家維修。
五、常見問題與解決
1. 溫度均勻度不符合要求
原因：均熱塊污染(如殘留的PCR產物)、溫度傳感器老化；
解決：清潔均熱塊(用無水乙醇擦拭)，更換溫度傳感器。
2. 熒光信號強度低
原因：ROI校準失敗(孔位映射錯誤)、背景熒光過高；
解決：重新進行ROI校準，運行背景校準(更換背景校準板)。
3. Ct值變異大
原因：溫度波動度超標(如加熱塊不穩(wěn)定)、熒光檢測器靈敏度下降；
解決：檢查加熱塊的溫度穩(wěn)定性(用多通道溫度校驗儀測量)，更換熒光檢測器。
六、總結
熒光定量PCR儀的校正是確保實驗數據準確可靠的關鍵步驟，需嚴格遵循行業(yè)標準(如JJF1527-2015、JJF(津)04-2020)，定期對溫控系統(tǒng)與光學系統(tǒng)進行校準。校準過程中需注意環(huán)境條件、專業(yè)支持與結果驗證，確保儀器的性能符合實驗要求。通過規(guī)范的校正流程，可有效減少實驗誤差，提高qPCR結果的準確性與重復性。
